兼并引物PCR扩增效率提升研究论文
克隆非模式生物的基因，往往要先用到兼并引物。兼并引物（亦称简并引物，degenerate primer），是多种不同但有相关性的引物的混合物。利用基因或其编码的蛋白质在进化上的相关性进行序列比对后，根据保守区域设计的引物，或者根据氨基酸序列设计的引物，一般会有一定的兼并度。利用兼并引物做PCR扩增时，由于兼并引物实际是多种引物的混合物，其中真正能和靶基因序列较好配对的只有少数几种，因此降低了PCR扩增中的有效引物浓度，导致扩增效率下降；同时也会显着提高其与非靶基因序列的配对，导致特异性下降，非靶基因扩增大量增加，当为了提高兼并引物的浓度以提高PCR扩增效率时，这点尤为明显。目前，能够改善兼并引物扩增的方法并不多，Knoth等用次黄嘌呤碱基替代引物中的兼并碱基，能够提高扩增效率[1],Don等的降落PCR（touchdown PCR）能够减少PCR的条件优化同时提高靶基因的扩增效率[2],也能提高兼并引物的扩增效率。然而这两种方法都不能完全解决兼并引物自身固有的缺点，其中，次黄嘌呤碱基由于能和不同碱基配对，实际上会增加非特异性扩增，而降落PCR对兼并引物PCR的改善很多时候并不明显。因此，需要一种既高效、又具有特异性的兼并引物PCR扩增方法。
抑制性PCR是一种特殊的PCR,它能利用单引物与待扩增片段的末 端反向重复 序列结合 进行扩增[3].PCR扩增过程中，末端反向重复序列能够互补配对，形成一种类似锅柄状的结构，模板内部的这种配对跟其与引物的配对存在竞争关系，因而会在一定程度上抑制PCR的扩增效率，抑制性作用的强弱受到末端反向重复序列的长度、引物浓度以及退火温度等因素的.影响，其中长末端反向重复序列、低引物浓度和低退火温度都能增强抑制性PCR的作用[3].本研究改进兼并引物的设计，将降落PCR与抑制性PCR有机结合起来，以提高兼并引物PCR扩增的特异性和效率。
1材料和方法
1.1微生物基因组DNA抽提
实验样品为温泉 的 底 泥 样 品。样 品 在 液 氮 中 研 磨 后，加 入10倍 体 积 的CTAB DNA抽 提 缓 冲 液（100mmol/L Tris-Cl pH8.0,10mmol/L EDTA,1.5mol/L NaCl,2% CTAB），然后加入0.1mg/mL的蛋白酶K,55 ℃水浴锅中温浴过夜。加入等体积的苯酚氯仿混匀，10 000r/min离心10min,取上清，加入等体积的异丙醇混匀，12 000r/min离心10min沉淀DNA,弃上清，加入70%乙醇清洗，12 000r/min离心5min,弃上清，风干10min,加去离子水溶解基因组DNA.
1.2利用抑制性PCR作用改善兼并引物扩增的原理
提高兼并引物PCR扩增效率和特异性的方法见图1.在兼并引物的5‘末端分别加上一段非兼并序列，两条兼并引物上所加的序列不一定与初始模板DNA配对。在PCR扩增目的基因片段时，加入低浓度的兼并引物，同时加入能与兼并引物中的非兼并区域序列相匹配的引物（蓝色或红色表示）。这样既能够抑制兼并引物的非特异性扩增，使非兼并引物在两轮PCR循环后就能正常发挥作用，同时也能够提高PCR扩增效率。此外，由于扩增过程中降低了兼并引物的浓度，能够有效降低非特异性扩增。在这种情况下，即使存在非特异性的单引物扩增，本方法由于引物增长，导致末端反向重复序列增长，使抑制性PCR作用增强，也能够达到抑制非特异性产物扩增的作用[3].抑制性PCR的这些特性，可以与降落PCR的最后低退火温度相结合。
1.3引物设计及PCR
根据GenBank数据库里其它聚酮类合成酶（Polyketide synthase,PKS）基因片段的序列比对（图2），选择序列保守区，设计带有5’端接头的兼并引物PKSF和PKSR,及接头引物T3P和SP6P.设计的引物序列 如 下：PKSF （5'-GAATTAACCCTCACTAAAGGGARGCNBHNCARHTNGAYCCNCARCA-3‘），PKSR（5'-GGATTTAGGTGACACTATAGATNCCNGTNCCRTGNVYYTC-3’），T3P（5'-GAATTA-ACCCTCACTAAAGGG-3‘），SP6P（5'-GGATTTAGGTGACACTATAGA-3’）。在终体积25μL的PCR反应液中加入10μmol/L的引物PKSF和PKSR各0.1μL,再加入1mol/L的引物T3P和SP6P各0.5μL,PCR反应液的其它成分与普通PCR相似。PCR程序如下：首先94℃预变性2min;随后15循环的94 ℃ 30s,65℃30s（-1℃/循环），72℃30s;然后30循环的94℃3s,50℃30s,72℃30s;最后72℃延伸10min.
2结果
2.1扩增PKS基因片段
结合降落PCR与抑制性PCR,本研究利用改变设计的引物扩增了温泉底泥样品微生物的PKS基因片段，PCR扩增后的产物经电泳检测，含有目的片段（图3箭头所示，泳道1和2为两次独立PCR）。目的片段经切胶回收后，克隆到pUCm-T载体（Sangon Biotech）。随机挑选两个用于测序。
2.2获得PKS基因片段序列分析
两个克隆获得的核酸序列及翻译的氨基酸如图4所示。两个克隆除了其兼并引物区序列不一致外，其余序列相同，证明为同一物种来源的基因片 段。将 除 兼 并 引 物 区 域 的 核 酸 翻 译 成 氨 基 酸 序 列 后，利 用BLASTP与GenBank上的蛋白质序列数据库进行比对，发现其与Gen-Bank上序列号为gb|AAO39790.1|的序列相似度最高，为77%.该序列是一种未知微生物的PKS基因片段，证明本研究获得了新的PKS基因片段。
3讨论
为了提高兼并引物的扩增效率和特异性，本研究改进了兼并引物的设计方法，延长了兼并引物，使其5‘增加了一段接头序列，利用该接头序列相匹配的引物，可以提高原有兼并引物扩增的效率。同时也由于引入了这段接头序列，使PCR可以在引物浓度较低的条件下进行，提高了PCR扩增的特异性，另一方面，对于产生的非特异性的单引物扩增，则有较强的抑制性PCR作用，降低了非特异性产物的扩增效率。利用该方法，本研究扩增获得了一种新的PKS基因的片段，证明该方法能够实现相似基因的高效扩增。
参考文献：
[1]Knoth K,Roberds S,Poteet C,et al.Highly degenerate,inosine-containing primers specifically amplify rare cDNA using the polymerasechain reaction[J].Nucleic Acids Research,1988,16（22）：10932.
[2]Don R H,Cox P T,Wainwright B J,et al.'Touchdown'PCR to circumvent spurious priming during gene amplification[J].NucleicAcids Research,1991,19（14）：4008.
[3]Dai Z M,Zhu X J,Chen Q,et al.PCR-suppression effect:kinetic analysis and application to representative or long-molecule biasedPCR-based amplification of complex samples[J].Journal of Biotechnology,2007,128（3）：435-443.
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