引言
气孔作为植物与外界环境进行气体交换（主要是CO2和H2O）的重要通道，在调节植物光合作用、蒸腾作用以及水分利用中扮演 着 至 关 重 要 的 角色[1].近年来通过研究气孔发育异常的突变体，发现了许多调控气孔发育的基因，因此对气孔发育基本遗传途径的认识越来越清晰。植物气孔发育受到多种环境因素影响，如二氧化碳和水蒸气，而研究表明一氧化氮（nitric oxide,NO）作为广泛分布于生物体内的活性小分子，参与了植物生长发育的许多过程[2].那么NO是否也能影响植物气孔发育，目前还没有相关报道，为了探究NO在气孔发育过程中的功能，本实验利用外源NO处理，以及NO含量变化突变 体，证 明NO调 节 拟 南 芥 气 孔 发 育 过 程，qRT-PCR结果表明，NO影响气孔发育相关基因MUTE、SCRM及SCRM2的表达。本结果为植物气孔发育的调控提供了新的证据，对于改良植物的抗旱性具有重要的理论价值。
1 材料与方法
1.1材料及处理方法
实 验 所 用 野 生 型 拟 南 芥 （Arabidopsisthaliana L.）为Columbia-0生态型，拟南芥突变体nox1（CS3156）和noa1（CS6511）均购于拟南芥信息资源库（The Arabidopsis Information Resource）拟南 芥 种 子 经 过 消 毒 液 （5% NaClO和0.01%Triton X-100）消毒5min后，无菌水清洗3次，4℃春化3d后播种于含1%蔗糖和0.8%琼脂的1/2MS培养基（pH 5.8）。
外源SNP处理时，先将种子在1/2MS培养基中萌发1d,然后移至提前添加不同浓度SNP的1/2MS培养基中，SNP浓度分别为0、10、20、30和40μmol·L-1.以上材料均置于拟南芥培养箱中，培养温度为22℃,光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为100μmol·m-2·s-1,湿度为80%~90%.
1.2实验方法
1.2.1显微技术取新鲜叶片投入脱色液（V乙醇 ∶V乙酸 =19∶1）中脱色1h,再将脱去叶绿素的叶片浸入透明剂中透明1h,然后用Olympus BX60微分干涉差显微镜（differential interference contrast microscope,DIC）照相。透明剂配方为：水合氯醛80g,甘油10mL,用水定容至100mL.
1.2.2气孔相关参数统计野生 型WT,突 变 体nox1（CS3156）和noa1（CS6511）三个株系分别随机选择十株七天的幼苗，观察统计幼苗子叶下表皮的气孔指数（stomatal in-dex,SI）和%（GMC+M）。拍照时每个子叶拍摄两个不重叠、避开叶脉和叶边缘的图片，借助ImageJ软件来统计SI和%（GMC+M），实验重复3次。
拟南芥的气孔发育要经历三种不同的前体细胞：拟分生组织母细胞（MMC）、拟分生组织细胞（M）和保卫母细胞（GMC）[3],为了更全面准确地分析气孔发育过程，一般将SI和%（GMC+M）作为衡量气孔发育 的 指 标。
SI=气 孔 数/（气 孔 数+表 皮 细 胞数）；%（GMC+M）=（保卫母细胞数+分生组织细胞数）/（保卫母细胞数+分生组织细胞数+气孔数+表皮细胞数）[4].实验数据用Microsoft Excel 2003软件进行处理，采用Origin 8软件作图，本文中所有统计作图中Error bars代 表 标 准 误 差 均 值。星 号 代 表 通 过student t test计算出的差异的显着性程度（*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001）。
1.2.3 RNA提取和qRT-PCRRNA提取：用Trizol（Invitrogen）提取生长七天幼苗的子叶RNA,每个株系选取100株幼苗，实验 重复3次，具体步骤如下：液氮研磨幼苗，加入1mL的Trizol,剧烈震荡15s,室温静置5min后移至冰上，4℃，12 000rpm,15min离心后取上层红色液体于新的EP管中，之后加入200μL氯仿震荡15s,室温静置2min.4 ℃，12 000rpm,15min离心后取上清于新的EP管中，加入500μL异丙醇，室温静置30min后再次4℃，12 000rpm,15min离心，吸去管中液体，留管底白色沉淀，用70%乙醇吹打沉淀使其悬浮，4 ℃，7 500rpm,5min离心后吸去乙醇，将EP管置于超净台干燥，最后加入20μLDEPC H2O溶解沉淀。
RNA反转录：用TOYOBO的反转录试剂盒将提取好的RNA反转为cDNA.总反应体系为20μL,反应程序为：RNA 1~2μɡ,oligo（dT）5pmol,10mmol·L-1dNTP 1μL,DEPC H2O补足到14μL,65℃孵育5min,取出后放置于冰上，向反应体系加入5×Reaction Buffer 4μL,RNase Inhibitor1μL,42℃保温2min后，加入1μL反转录酶，于42℃反应50min之后，72℃孵育15min将反转录酶灭活。反应结束后样品降温至4℃，cDNA保存于-20℃备用。
荧光定量PCR:定量分析气孔发育相关基因的表达量，先 按 照 上 述 方 法 提 取RNA,反 转 录 成cDNA,本实验使用UBQ5作为内参基因，实验所用引物序列见表1,扩增中SYBR-green作为荧光染料，反应程序为：95℃ 3min,95℃ 15s,58℃ 15s,72℃15s,读取荧光值，重复上述步骤，45个循环；95℃10s;60℃到95℃做 溶 解 曲 线，每5s升 温0.5℃并读取一次荧光值。
所有实验都进行了3次以上的重复，每次生物重复 都 包 含3次 技 术 重 复。 使 用Comparativethreshold cycle（Ct）方法来计算扩增产物的相对量。
2 结果与讨论
2.1外源NO对拟南芥叶片气孔发育的影响
环境因素能够影响气孔运动，也能影响气孔发育。在拟南芥中，提高CO2水平能够降低植物的气孔密度（单位叶面积内的气孔数目）[5],最新研究表明，编码β-碳酸酐酶的两个基因CA1,CA2和CO2诱导产生的蛋白酶CRSP共同参与了CO2对气孔发育的影响[6].高光强也能提高气孔指数[7].目前已知NO能够激活MAPK信号通路[8],而MAPK信号级联在气孔发育中起至关重要的作用[9].
SNP处理WT后统计幼苗子叶下表皮的气孔指数和%（GMC+M），如图1,外源SNP处理使拟南芥幼苗子叶下表皮的气孔数增多，拟分生组织细胞（M）和保卫母细胞（GMC）数目增多；SNP处理提高了拟南芥气SI和%（GMC+M），并且在10~30μmol·L-1SNP浓 度 范 围 内，随 着 浓 度 升 高，SI和%（GMC+M）均显着增加。实验结果表明，外源NO能提高SI和%（GMC+M）
2.2拟南芥内源
NO含量变化对气孔发育的影响观察WT,noa1,nox1萌发七天的幼苗子叶下表皮，统计SI和%（GMC+M），如图2,NO降低突变体noa1子叶表皮的气孔数少于WT,而NO升高突变体nox1子叶表皮的气孔数目和拟分生组织细胞（M）和保卫母细胞（GMC）数目均高于WT;NO含量降低突变体noa1的SI和%（GMC+M）均显着低于WT,而NO含量升高突变体nox1的SI和%（GMC+M）均显着高于WT.
2.3 NO影响气孔发育相关基因的表达
近年来发现了许多调控气孔发育的基因，研究发现拟南芥中有五个编码bHLH蛋白的基因调控气孔 世 系 的 起 始 和 发 展，包 括SPEECHLESS（SPCH）、MUTE、FAMA、SCRM（ICE）、SCRM2[10,11].SCRM和SCRM2通 过 与 三 个bHLH转录因子形成异二聚体，分别特化气孔发育中的三步级联：
SPCH和SCRM/SCRM2启动气孔世系的第一次不对称分裂，而MUTE和SCRM/SCRM2促进拟分生组织细胞向保卫母细胞（GuardMother Cell,GMC）的转变。
研究表明，mute突变体中，拟分生组织细胞（M）增多，而在scrm1-2中GMC-like细胞增多，scrm1-2scrm2-1/+中拟分生组织细胞（M）增多[11].而我们的结果表明，NO也会导致%（GMC+M）升高，为了探究NO是否通过这些基因调控%（GMC+M）,利用qRT-PCR技术，比较分析了WT、nox1、noa1中气孔发育相关基因MUTE、SCRM和1的表达，如图3,结果显示，nox1中MUTE,SCRM和SCRM2三个基因的表达均低于WT,而noa1中这三个基因的表达均高于WT.同时，30μM SNP处理WT后，MUTE,SCRM和SCRM2表达水平均低于对照组，和nox1一致，表明NO影响了气孔发育相关基因MUTE,SCRM和SCRM2的表达。
以 上 结 果 表 明，NO可 能 通 过 调 控MUTE,SCRM和SCRM2三个基因的表达影响了拟南芥气孔发育过程中的细胞转变，使更多的细胞停留在拟分生组织细胞（M）和保卫母细胞（GMC）时期，因此导致了%（GMC+M）水平的提高。目前尚不清楚NO如何在阻碍部分细胞分化的同时提高SI,由于影响气孔发育有多条信号通路[12],因此我们推测NO可能通过影响其他基因来影响气孔指数。
3 结论
SNP处理WT后的SI和%（GMC+M）均高于对照 组，并 且NO升 高 突 变 体nox1的SI和%（GMC+M）显着高于WT,而NO降低突变体noa1的SI和%（GMC+M）均低于WT.这些内源NO含量变化突变体气孔的异常发育表明，内源NO对于拟 南 芥 气 孔 发 育 具 有 重 要 的 作 用。
MUTE、SCRM和SCRM2调控气孔发育，MUTE促进拟分生组 织 细 胞 （M）向 保 卫 母 细 胞 （GMC）的 转 变，SCRM和SCRM2所编码的蛋白以二聚体的形式辅助MUTE行使功能已见报 道，qRT-PCR结 果表明，nox1中MUTE、SCRM、SCRM2的表达水平均低于WT,外源SNP处理结果与nox1一致，而noa11MUTE、SCRM、SCRM2的 表 达 水 平 均 高 于WT.综 上 所 述，NO可 提 高 拟 南 芥 的SI和%（GMC+ M）水 平，同 时 调 控 气 孔 发 育 相 关 基 因MUTE、SCRM、SCRM2的表达。
NO作为一种重要的信号分子，通过调控基因的转录水平以及转录后蛋白修饰参与植物发育过程。同时，植物气孔的发育受多条信号途径的调节。
本实验 的 结 果 表 明，NO可 能 通 过 调 控MUTE、SCRM、SCRM2等基因的表达影响拟南芥气孔发育1%（GMC+M）的水平。关于NO如何调控这些基因的表达，以及如何影响SI还需要进一步的研究和探索。