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家兔克隆骨髓基质细胞的体外培养
【摘要】 目的：探讨家兔骨髓基质细胞在体外传代的培养。方法 取家兔股骨骨髓，分离骨髓基质细胞，于1640培养体系中培养，之后固定计数。结果 在2~6×106 个/cm2范围内，其接种细胞数与所形成的克隆集落(CFU-F)数呈良好线性关系。随着培养时间的延长，克隆集落也增多，变大。3周龄家兔的造血基质祖细胞较6周龄者为多。结论 基质祖细胞CFU-F呈非均质性的，可能存在不同亚群。
【关键词】 家兔;骨髓;造血基质祖细胞;克隆
骨髓基质细胞是支持和调节造血细胞定居、增殖、分化、发育和成熟的内环境主要细胞成分[1]。曾对小鼠体外单层培养造血基质细胞的`培养研究，发现其接种的细胞数与成集落数呈良好的线性关系[2]。目前对家兔的骨髓器官基质细胞的研究国内研究有过报道[3]。本文用体外培养骨髓基质细胞技术[4]对家兔的骨髓基质细胞体外培养特点进行了探讨。
1 资料与方法
1.1 材料来源 实验动物系北京科宇动物养殖中心饲养的雌雄两性、3~6周龄之纯种家兔。
1.2 主要试剂与器材 RPME1640培养液，小牛血清(中国药品生物制品检定所)，平底中性玻璃培养瓶，二氧化碳孵箱，微孔滤网。
1.3 骨髓单个核细胞制备 6周龄家兔用乙醚麻醉处死;3周龄者则用颈椎脱臼致死。在无菌条件下取双侧股骨修洁后剪掉骺端，用带16号针头注射器以1640培养液冲出骨髓细胞，再用滤网过滤制取单个核细胞悬液，计数后用所需细胞量进行体外CFU-F培养。
1.4 CFU-F培养和测定 将6周龄家兔的骨髓细胞以2×106 个/cm2, 3周龄的以2~6×106 个/cm2置于含20%小牛血清的1640培养液的培养体系的培养瓶中，于37℃，5%CO2，饱和湿度的CO2培养箱内培养。分别于第4天，第6天用含20%小牛血清的1640培养液换液，培养到第八天冲洗后用甲醛固定半小时，蒸馏水冲洗后用姬姆萨染色12 min后晾干，待计数用。
2 结果
2.1 CFU-F克隆集落形成过程观察 于培养第4天在倒置显微镜下观察培养细胞，发现淡红色背景下(红细胞)有圆形发亮的较大基质细胞生长，拉长的细胞较少见，振荡后观察未见发亮细胞浮起，说明细胞已贴壁。培养第六天镜下观察，发现基质细胞明显增多，拉长者较多，形成了克隆集落，6周龄的骨髓基质细胞 生长速度明显低于3周龄者，且培养同天数的6周龄的克隆集落数明显低于3周龄的克隆集落数。
2.2 CFU-F计数 计数由50个以上细胞所形成的集落数，结果如图1、2和表1。由50~99个细胞组成的集落为小集落，由100~199个细胞组成的集落为中集落，>200个细胞者的为大集落。
3 讨论
从以上述结果可以发现：培养时间越长，形成克隆集落相对越多，3周龄者，骨髓细胞较多，造血基质祖细胞也较多，形成的克隆集落数也多。在2~6×106个/cm2范围内，形成的克隆集落数与种植细胞数呈良好的线性关系。
通过对集落大小，所含细胞数与密度比较，表明CFU-F非均质性的，可能存在不同亚群。这对体外培养骨髓细胞的增殖与分化有一定的指导意义。
参考文献
[1] 姚程，彭丽萍，姜振宇,等.骨髓基质细胞体外扩增能力及支持造血的研究.白求恩医科大学学报,2001,17(4)：386-388.
[2] 于洪臣, 郭占之, 毕晓颖, 等.白求恩医科大学学报, 1991,17(3):219.
[3] 王春艳，何欣，李增新,等.兔骨髓基质细胞的分离培养研究.北华大学学报，2005,6(6)：520-522.
[4] 蔡国锋，黄开，章庆国.兔骨髓基质干细胞体外培养的实验研究.东南大学学报，2006，25(1)：16-19.
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