3 在中药领域中的应用
3. 1 基因表达分析
荧光定量PCR 最普遍的应用是基因表达分析。从基础科学研究到实际应用，检测基因表达都是基本的也是很重要的一项工作。Olofsson 等对黄花蒿不同组织中萜类代谢途径上的基因进行表达差异分析，为评估青蒿素的前体对青蒿素产量的影响提供科学参考。植物在生物和非生物胁迫下，基因表达水平的相对变化与次生代谢产物累积相关性的研究越来越受到科研工作者的青睐。如Cheng 等用YE、Ag + 和MeJA 3 种诱导子组合诱导丹参毛状根。结果发现，在处理24、36 h 后，SmCPS 的表达量显著上调，次生代谢产物隐丹参酮和二氢丹参酮Ⅰ的含量也随之显著上升，这表明丹参酮类化合物含量的升高可能与SmCPS 基因表达量的上调有关。在植物的不同发育阶段，其次生代谢产物的累积量及基因的表达水平也会不同。如Kim 等对人参在叶片不同开放期( 闭合阶段、中间阶段、全开放阶段) 其体内人参皂苷及生物合成途径上的关键酶基因进行检测。结果显示，在中间阶段和全开放阶段人参皂苷生物合成途径上的酶基因PgSS 和PgSE 的表达量比闭合阶段增加约1. 5 倍，PgDDS 的表达量则增加4 倍以上; 主根和侧根中，人参皂苷的含量在叶片开放的中间阶段达到最大值，而叶片中人参皂苷的含量在全开放阶段达到最高。此外，实时荧光定量的差异表达分析在中药领域得到广泛应用，如在甘草、黄花蒿等药用植物中都有大量的研究。
3. 2 中药品种及真伪鉴别
中药的真伪直接影响临床用药的准确性和中药的质量，因此对于中药品种真伪的鉴别历来是中药研究中极为重要的工作。Xue 等依据骨碎补的正品及其混淆品trnLtrnF间隔序列，设计Scorpion 探针，通过实时荧光定量对骨碎补的真伪进行鉴别，同时对多个混合样品( 正品中加入一种混淆品，按一定比例梯度混合)建立标准曲线，以分析正品中混淆品的掺入量。另外，Xue 等基于升麻及其替代品之间内转录间隔区( ITS) 序列的长度、鸟嘌呤( G) 、胞嘧啶( C) 含量的差异，采用LightCycler 定量仪扩增升麻及其替代品的ITS 序列，并分析各产物的熔解曲线。通过解链温度的差异区分鉴别升麻及其替代品，为快速、稳定鉴别升麻及其替代品建立了标准。董玉茹等将限制性内切酶引入熔解曲线分析中，建立了一种新的单核苷酸多态性( SNP) 分型方法，成功实现了对金银花与山银花、白术与苍术品种及真伪的鉴别。此外，有研究者基于实时荧光定量PCR 技术，分别对铁皮石斛近缘种冒充铁皮石斛以及三七粉掺假等现象建立快速的检测方法。
4 小结
植物在生长、发育及受外界环境刺激等过程中，其基因在不同时空的表达存在着很大差异。对基因的表达量进行差异分析，是了解生物体生长、发育和调控等机理的一个重要内容。Northern 杂交、Southern 杂交和原位杂交等都可以用来进行目的基因的定量分析，但这些方法耗时且敏感性较差。普通PCR 终点定量的缺陷是扩增出来的DNA 产物需要通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭( EB) 染色后才可以显示出来，这些步骤耗时且不易精确定量。此外，由于酶动力学的特点，在PCR 反应进程中有基线期、早期指数期、对数-线性期和平台期，理论上来说，所有样本的DNA 扩增量最后是相同的，但实际上，不同样本的平台期是不一样的。在这种情况下，通过终点定量分析，反而将反应效率中很小的差别放大出来，造成定量的不准确。实时荧光定量为起始定量，误差相对较小，这使其在定量方面得到快速的发展。PCR 产物长度或组成不同，其熔解曲线( 熔链温度) 也存在差异，因此可根据熔解曲线的差异进行物种的鉴别。中药鉴定要解决其中一个很重要的问题就是真伪。实验过程中，我们可通过设计特异性引物来扩增不同的样品，从而得到不同的PCR 产物，再根据相应的熔解曲线鉴定中药材的真伪和掺伪的中药材。此外，实时荧光定量PCR 还可广泛用于等位基因分析及转基因生物检测等。
实时荧光定量PCR 自建立以来，发展迅速、应用广泛，拥有许多优点。近年来，许多科研工作者基于实时荧光定量PCR 的基本原理对其进行不断地研究和改进，使实时荧光定量PCR 得到了进一步的完善。随着实时荧光定量PCR 的不断标准化，该技术将在生物学、医学基础研究等科研领域中得到更加广泛的推广与应用。
【实时荧光定量PCR研究进展及其在中药领域的实践的论文】相关文章：
6.PCR自我鉴定
8.医学实践的论文