第三章 细胞生物学研究方法
第一节 细胞形态结构的观察方法
一、光学显微镜技术
1、普通复式光学显微镜技术
普通光学显微镜（ 最大分辨率为 0.2μm）,主要由三部分组成：①光学放大系统，即目镜和物镜；②照明系统；③机械和支架系统。
显微镜的性能优劣决定于它的分辨率。 分辨率是指显微镜区分开相近两点的能力。
D= 0·61λN · sinɑ/2
λ为光源波长,α为物镜镜口角 。
2、荧光显微镜技术在紫外光显微镜基础上发展而来，利用样品自发荧光和诱发荧光，可以 对某些生物大分子进行定性和定位研究 。不仅可以观察固定切片标本，还可以在活体染色后对活细胞进行研究。
3、激光共焦点扫描显微镜 技术共焦点是 指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。
它 在某一瞬间只用一束通过检测器前的小孔的光成像，
可显著提高分辨率。可以观察较厚样品的内部结构。
4、相差显微镜技术和微分干涉显微镜技术
光线在通过密度不同的介质时，其滞留程度不同，
即产生了光程差和相位差。相差显微镜 的基本原理把光程差变成振幅差 (即明暗 )。从而提高样品反差，故样品不需染色,适合观察活细胞 。甚至研究细胞核、
线粒体等细胞器的动态。它在结构上与普通显微镜 最大的不同是在物镜后装有相差板。
微分干涉显微镜用的是偏振光，增加了样品反差，
并具有立体感，可作于 研究活体细胞 中较大的细胞器。
录像增差显微镜技术在一定程度上可以填补光镜与电镜之间分辨率上的间隙。
二、电了显微镜技术
（一）电了显微镜基本知识
分辨率最终决定于光的波长，由于使用电子束作光源，电镜的分辨率大大提高。电镜的分辨率常常是超薄切片厚度的 1/10，它的 分辨率可达 0.2nm，其放大倍数为 106倍。
电镜的基本构造包括：①电子束照明系统 ；②电磁透镜成像系统；③真空系统；④记录系统；⑤电源系统。（ P52表 3-1）
（二）主要电镜制样技术介绍人
样品制备技术的特殊要求：①样品要薄；②更好地保持样品的精细结构；③样品具有一定的反差。
主要的用于观察生物样品的电镜技术有：① 超薄切片技术 ；是观察细胞超微结构的基础。②负染色技术；③冷冻断裂和冷冻蚀刻电镜技术技术；④ 电镜三维重构技术；⑤扫描电镜技术（ SEM）是观察细胞表面形的有力工具。
三、扫描隧道显微镜 (STM)
是一种探测微观世界物质表面形貌的仪器，在纳米生物学的研究领域具有独特的优越性。
STM的特点：①具有原子尺度的高分辨本领；②
可在真空、大气、液体等条件下工作；③非破坏性测量。
第二节 细胞组分的分析方法
细胞成分分析和形态学观察相结合，可揭示生物大分子在细胞内的构建及功能。
一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物
利用多种方法使细胞崩解，形成细胞器和细胞组分的混合匀浆，再通过差速离心，即利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。
差速离心与密度离心相结合可以达到精确的分离。
细胞不同组分沉降率不同，主要依赖于它们的形状和大小，通常以沉降系数 S来表示 (沉降系数是指悬浮在密度较低的溶剂中的一种溶质大分子，在每单位离 心场作用下的沉降速率 )。
二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂质等到的显色方法
原位成分分析常利用一些显色剂与所检物质的特殊基团特异性结合的特征，通过染色反应的部位和颜色的深浅来断某种物质在细胞内的分布与含量。
福尔根 (Feulgen)反应可特异显示 DNA的存在部位。
PAS反应可确定多糖的存在。
四氧化锇 可证明脂肪滴的存在。苏 丹 Ⅲ 和苏丹黑也常用于脂肪的鉴定。
米伦反应及重氮反应等用来测定蛋白质。
检测和定位酶的技术是基于细胞或组织切片与适宜底物共同孵育，通过一定方法使产物显示出来 。例如检测碱性磷酸酶的格莫瑞方法。
三、特异蛋白质抗原的定位与定性
免疫荧光和免疫电镜是最常用的细胞内蛋白质定位技术。
1、免疫荧光技术
免疫荧光技术就是将免疫学方法与荧光标记技术相结合研究特异蛋白质抗原在细胞内分布的方法。
2、免疫电镜技术
免疫电镜技术使特异蛋白的定位与超 微结构结合起来，使抗原定位更准确。如蛋白分泌的研究胞内酶的研究；一些结构蛋白的研究。
四、细胞内特异核酸的定位与定性
1、原位杂交技术
用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或细胞中的位置的方法。
2,Southern技术（了解）
蛋白样品经电泳后，与 DNA探针进行吸附，与
DNA有亲合作用的蛋白带被显示出来。
五、利用放射性标记技术 研究生物大分子在细胞内的合成动态
放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用，对样品中放射性标记物进行定性与定位测定。
放射自显影技术包括两个主要步骤：即同位素标记的大分子前体的掺入和细胞内同位素所在位置的显示。
基本步骤为：掺入、制片、敷胶、曝光、显影、
镜检。
六、定量细胞化学分析技术
1、显微分光光度测定技术
根据细胞内某些物质对光谱吸收的原理，来测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。
2、流式细胞仪
可定量地测定某一细胞中的 DNA,RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量。
第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
一、细胞培养
细胞培养 就是将动植物组织或细胞从机体取出，
分散成单个细胞 或直接以单细胞 生物，给予必要的生长条件，让其在培养瓶中或培养基上继续生长与增殖。
（一）动物细胞培养
从机体取出立即培养的细胞叫 原代细胞 。适应在培养条件下持续传代培养的细胞为 传代细胞 。
通过纯系化或选 择法从原代培养细胞中分离出来的细胞群体叫 细胞株,细胞分裂周期约限于 50— 60次。
从原代细胞或细胞株中获得的可无限传代的细胞叫 细胞系 。
（二）植物细胞培养
单倍体细胞培养。
原生质体培养：去壁的植物细胞叫原生质体。可培养成植株或体细胞杂交植株。
（三）非细胞体系在细胞生物学研究中的作用
来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了正常生物学反应所需的物质（供能系统和酶反应体系等）组成的体系即为非细胞体系。
二、细胞工程
应用细胞生物学方法，按照预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传物质的技术以及发展这种技术的领域为 细胞工程 。
细胞工程所使用的技术主要是细胞培养、细胞分化的定向诱导、细胞融合和显微注射等。
（一）细胞融合与细胞杂交技术
真核生物的体细胞经过培养，两个或多个细胞融合成一个双核 或多核细胞的过程叫细胞融合。
动物细胞融合一般要用灭活的病毒 (如仙台病毒 )
或 化学物质 (如聚乙二醇，即 PEG）介导；植物细胞事例时，要用纤维素酶去掉纤维素壁 。
20世纪 80年代又发明了电融合技术。
细胞融合可以在基因型相同的细胞间进行，也可以在基因型不同的种内细胞间甚至种间细胞间进行。
（二）单克隆抗体技术
1975年英国学者 Milestein等开创了将产生抗体的单个细胞同瘤细胞杂交的技术。他们的设计是经绵羊红细胞免过的小鼠脾细胞 (B淋巴细胞 )与骨髓瘤细胞融合，
融合的杂交瘤具有两种亲本细胞的特性即可分泌抗绵羊红细胞的抗体，又可无限增殖。学者们纷纷利用这一技术来制备针对不同抗原的高度纯一的单克隆抗体。
单克隆抗体 就是单个杂交瘤细胞 增殖产生的克隆细胞群分泌的高度纯一的抗体。
（三）细胞折合与显微操作技术
细胞拆合就是把细胞核与质分离开后将不同来源的细胞质与细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。
显微操作技术：即在显微镜下用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射的技术。
思考题
1、解释名词；细胞培养，细胞系，细胞株，单克隆抗体，细胞工程
2、什么叫显微镜分辨率？怎样才能增加分辨率？
3、比较光镜与电镜的异同？
4、光学显微镜技术有哪些新发展？它们各有哪些突出的优点？